Inducción de ferroptosis de células de glioblastoma mediante tratamiento combinado con cloranfenicol y 2

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 10497 (2023) Citar este artículo

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El glioblastoma, un tumor maligno, no tiene tratamiento curativo. Recientemente, las mitocondrias se han considerado un objetivo potencial para el tratamiento del glioblastoma. Anteriormente, informamos que los agentes que iniciaban la disfunción mitocondrial eran eficaces en condiciones de escasez de glucosa. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un tratamiento dirigido a las mitocondrias para lograr condiciones normales de glucosa. Este estudio utilizó U87MG (U87), U373 y células madre similares derivadas de pacientes, así como cloranfenicol (CAP) y 2-desoxi-d-glucosa (2-DG). Investigamos si CAP y 2-DG inhibieron el crecimiento de las células en concentraciones de glucosa normales y altas. En las células U87, la administración de 2-DG y CAP a largo plazo fue más eficaz en condiciones de glucosa normal que en condiciones de alto contenido de glucosa. Además, el tratamiento combinado con CAP y 2-DG fue significativamente efectivo bajo una concentración normal de glucosa tanto en oxígeno normal como en condiciones hipóxicas; esto se validó en U373 y en células similares a madres derivadas de pacientes. 2-DG y CAP actuaron influyendo en la dinámica del hierro; sin embargo, la deferoxamina inhibió la eficacia de estos agentes. Por tanto, la ferroptosis podría ser el mecanismo subyacente a través del cual actúan 2-DG y CAP. En conclusión, el tratamiento combinado de CAP y 2-DG inhibe drásticamente el crecimiento celular de líneas celulares de glioblastoma incluso en condiciones normales de glucosa; por lo tanto, este tratamiento podría ser eficaz para los pacientes con glioblastoma.

El glioblastoma es uno de los tumores cerebrales más malignos, de mal pronóstico y sin tratamiento curativo1,2,3. La temozolomida es un tratamiento estándar para el glioblastoma; sin embargo, prolonga la supervivencia sólo 2,5 meses3. Además, las células de glioblastoma se vuelven resistentes a la temozolomida y las mitocondrias se asocian con esta resistencia3,4,5.

Las mitocondrias son importantes en la producción de trifosfato de adenosina, la dinámica del calcio, la β-oxidación y la generación de especies reactivas de oxígeno6. Las mitocondrias también están asociadas con diversas enfermedades, incluidos los tumores malignos, especialmente en las células madre cancerosas7,8. Por lo tanto, investigamos un tratamiento dirigido a las mitocondrias para el glioblastoma.

Nuestro estudio anterior encontró que los agentes antimicrobianos, incluidos el cloranfenicol (CAP) y la doxiciclina, son eficaces para tratar el glioblastoma en condiciones de falta de glucosa porque las células del glioblastoma se vuelven dependientes de las mitocondrias en esta condición9. Una administración de 3 días de estos agentes antimicrobianos fue ineficaz en concentraciones de glucosa normales o altas9. En consecuencia, en este estudio, nuestro objetivo fue desarrollar un tratamiento eficaz para el glioblastoma en condiciones de concentración normal de glucosa.

La 2-desoxi-d-glucosa (2-DG), un análogo de la glucosa, inhibe las actividades de hexoquinasa y fosfoglucosa isomerasa, bloqueando la glucólisis10. Además, la 2-DG imita las condiciones de falta de glucosa, induce estrés oxidativo mitocondrial e inhibe el crecimiento de células cancerosas10. Aunque Singh et al.11 informaron un tratamiento combinado con 2-DG y radioterapia para el tratamiento del glioblastoma, este enfoque no se utiliza en la práctica clínica. Sin embargo, la 2-DG se utilizó en algunos ensayos clínicos para cánceres o tumores sólidos12,13.

En el entorno tumoral, las células existen en condiciones de hipoxia y falta de glucosa, lo que debe considerarse en el desarrollo de tratamientos para el glioblastoma14,15. En este estudio, se investigó la eficacia del tratamiento tanto en condiciones normales como hipóxicas. Además, los resultados del análisis de líneas celulares se validaron utilizando células similares a células madre que imitan una condición in vivo.

Los mecanismos subyacentes a la muerte celular causada por cada agente varían, incluyendo apoptosis, necroptosis y ferroptosis9,16. La ferroptosis es una forma de muerte celular que actualmente está llamando la atención. En nuestro estudio anterior, la CAP provocó la muerte celular mediante ferroptosis en condiciones de falta de glucosa9. La ferroptosis tiene varios marcadores, incluidos FTH1, GpX4, KEAP1 y NRF2. Además, el ARNm, PTGS2, CHAC1 y HO-1 están relacionados con la ferroptosis17. Uno de los inhibidores de la vía de la ferroptosis es la deferoxamina (DFO)9.

Este estudio tuvo como objetivo investigar la eficacia de un tratamiento dirigido a las mitocondrias en condiciones normales de glucosa. Examinamos la eficacia de CAP y 2-DG individualmente y combinados. Además, investigamos los mecanismos subyacentes a la muerte celular causada por estos agentes.

En nuestro estudio anterior, CAP solo fue efectivo en condiciones de falta de glucosa dentro de los 3 días y no en condiciones normales o altas de glucosa9. Sin embargo, los datos de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) revelaron que la fosforilación oxidativa (OXPHOS) estaba más activada en concentraciones normales de glucosa que en concentraciones altas de glucosa9. Teniendo en cuenta este resultado, investigamos el efecto de la administración de CAP a largo plazo. Observamos que la administración de CAP durante 7 días fue más efectiva en condiciones normales de glucosa que en condiciones altas de glucosa (Fig. 1a, b). Aunque las células murieron en concentraciones normales de glucosa, este efecto disminuyó en concentraciones altas de glucosa, lo que resalta la importancia del control de la glucosa durante el tratamiento.

Efectos del cloranfenicol (CAP) y 2-desoxi-d-glucosa (2-DG) en diferentes condiciones de glucosa. (a) El efecto de la administración de CAP durante 7 días en U87 (se sembraron 2 × 104 células) en condiciones de glucosa normales (1000 mg/l) y altas (4500 mg/l). CAP es eficaz en condiciones normales de glucosa. (b) El número de células con CAP en concentraciones de glucosa de 1000 y 4500 mg/L en relación con el control muestra que CAP es eficaz en condiciones normales de glucosa (las células se sembraron en una placa de seis pocillos y se contaron usando un contador Coulter). (c) El efecto de la administración de 2-DG durante 3 días en U87 en condiciones normales y altas de glucosa; 2-DG es eficaz en condiciones de 1000 mg/L de glucosa. (d) El número de células con 2-DG en concentraciones normales y altas de glucosa en relación con el control muestra que 2-DG es eficaz en condiciones normales de glucosa (las células se sembraron en una placa de seis pocillos y se contaron usando azul tripano). Los valores se presentan como media ± desviación estándar. La prueba t de Student se realizó en condiciones de glucosa normal versus condiciones de glucosa alta. ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Posteriormente utilizamos 2-DG porque inhibe la glucólisis, imitando condiciones de falta de glucosa10. Además, se ha considerado la 2-DG para el tratamiento de cánceres y tumores sólidos12,13. Esperábamos que 2-DG inhibiera el crecimiento celular solo o en combinación con CAP. La administración de 3 días de 2-DG disminuyó el número de células en concentraciones normales de glucosa (Fig. 1c, d). El efecto de este fármaco también disminuyó en condiciones de niveles altos de glucosa.

Planteamos la hipótesis de que el tratamiento combinado de CAP y 2-DG es eficaz y, por lo tanto, evaluamos si las células de glioblastoma disminuyeron después de la administración de estos agentes durante 3 y 5 días. El tratamiento combinado fue eficaz y el crecimiento celular se inhibió en condiciones normales de glucosa (Fig. 2a, b, Fig. Suplementaria S1a-d). Además, el recuento celular mostró efectos combinados en CAP y 2-DG. Sin embargo, bajo concentraciones altas de glucosa, la efectividad de la terapia combinada disminuyó (Fig. 2c,d). Este tratamiento combinado es eficaz porque el 2-DG crea condiciones de falta de glucosa.

Efectos del tratamiento combinado, incluido cloranfenicol (CAP) y 2-desoxi-d-glucosa (2-DG), en diferentes condiciones de glucosa. (a) El efecto de la administración durante 5 días de CAP y 2-DG en U87 en condiciones normales de glucosa. El tratamiento combinado fue eficaz. (b) Número de células con cada agente bajo una concentración de glucosa de 1000 mg/L (las células se sembraron en una placa de seis pocillos y se contaron usando un contador Coulter). (c) El efecto de la administración durante 5 días de CAP y 2-DG en U87 en condiciones de niveles altos de glucosa. (d) Número de células con cada agente bajo una concentración de glucosa de 4500 mg/L (las células se sembraron en una placa de seis pocillos y se contaron usando un contador Coulter). Los valores se presentan como media ± desviación estándar. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de análisis de varianza unidireccional ordinaria con la prueba de comparación múltiple de Tukey que evalúa Ct frente a CAP frente a 2-DG frente a CAP + 2-DG. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

La expresión de COX1 aumentó después de la administración de 2-DG (Fig. 3a, b). Por lo tanto, monitoreamos el OCR para evaluar OXPHOS y encontramos que el OCR fue mayor bajo la administración de 2-DG que el control y que el OCR disminuyó en el grupo CAP (Fig. 3c, d). Teniendo en cuenta estos resultados, 2-DG imita las condiciones de falta de glucosa, lo que aumenta la eficacia de CAP. Posteriormente, consideramos que esta condición de privación de nutrientes conduce a un aumento en la actividad de oxidación de los ácidos grasos para producir energía. Para detectar la OCR derivada de la activación de ácidos grasos se utilizó etomoxir, un inhibidor de la carnitina palmitoiltransferasa 1A (CPT1A)18,19. La OCR disminuyó cuando se inyectó etomoxir (Figura complementaria S2a, b).

La 2-desoxi-d-glucosa (2-DG) hace que las mitocondrias de las células sean dominantes y aumenta la tasa de consumo de oxígeno (OCR). (a) 2-DG aumentó la expresión de COX1 en U87 después de 3 días. (b) Cuantificación de la expresión de COX1 (N = 3). Los valores se presentan como media ± desviación estándar. La prueba t de Student se realizó en condiciones de glucosa normal versus condiciones de glucosa alta. **P<0,01. (c) Trazas de OCR en cada agente administrado y (d) cuantificación de la respiración máxima. Se realizó un análisis de varianza unidireccional ordinario con la prueba de comparación múltiple de Tukey para evaluar Ct versus CAP versus 2-DG versus CAP + 2-DG. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001.

En el entorno biológico, las células existen en condiciones hipóxicas y de escasez de nutrientes14,15. Evaluamos si la efectividad del tratamiento combinado en condiciones hipóxicas (O2 = 1% es suficiente para desencadenar una respuesta hipóxica (Figura complementaria S3a, b) y descubrimos que el crecimiento celular se inhibió en condiciones normales de glucosa (Figura 4a, b). Además, los efectos de CAP y 2-DG fueron positivos, sin embargo, bajo altas concentraciones de glucosa, su efectividad disminuyó (Fig. 4c,d).

Efectos del tratamiento combinado, incluido cloranfenicol (CAP) y 2-desoxi-d-glucosa (2-DG), en diferentes condiciones de glucosa en hipoxia. (a) El efecto de la administración durante 5 días de CAP y 2-DG en U87 en condiciones normales de glucosa en hipoxia (O2 = 1%). El tratamiento combinado fue eficaz. (b) Número de células con cada agente bajo una concentración de glucosa de 1000 mg/L (las células se sembraron en una placa de seis pocillos y se contaron usando un contador Coulter). (c) El efecto de la administración durante 5 días de CAP y 2-DG en U87 en condiciones de niveles altos de glucosa. (d) Número de células con cada agente bajo una concentración de glucosa de 4500 mg/L (las células se sembraron en una placa de seis pocillos y se contaron usando un contador Coulter). Los valores se presentan como media ± desviación estándar. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de análisis de varianza unidireccional ordinaria con la prueba de comparación múltiple de Tukey que evalúa Ct frente a CAP frente a 2-DG frente a CAP + 2-DG. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Finalmente, utilizamos células madre derivadas de pacientes para validar los efectos del tratamiento imitando una condición in vivo. Aunque la administración única de CAP o 2-DG fue ineficaz, el tratamiento combinado fue eficaz en las células de la neuroesfera (Fig. 5a, b). Las neuroesferas eran más pequeñas y el número de esferas disminuyó (Figura complementaria S4a, b).

Efectos del tratamiento combinado en células similares a madres derivadas de pacientes. (a) El efecto de la administración durante 7 días de cloranfenicol (CAP) y 2-desoxi-d-glucosa (2-DG) en KNS1451 en condiciones normales de glucosa. El tratamiento combinado fue eficaz. (b) Número de células con cada agente bajo una concentración de glucosa de 1000 mg/L (las células se sembraron en una placa de seis pocillos y se contaron usando azul tripán). Los valores se presentan como media ± desviación estándar. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de análisis de varianza unidireccional ordinaria con la prueba de comparación múltiple de Tukey que evalúa Ct frente a CAP frente a 2-DG frente a CAP + 2-DG. **P<0,01.

Investigamos los mecanismos subyacentes a la eficacia del tratamiento combinado. Como se informó anteriormente, la inyección de CAP provoca la muerte celular mediante ferroptosis en condiciones de falta de glucosa9. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la ferroptosis es la base de la eficacia del tratamiento combinado. Durante la administración de CAP, el nivel de ARNm de los marcadores de ferroptosis, incluidos PTGS2 y CHAC1, aumentó (Fig. 6a, b, Fig. Suplementaria S5a). En cuanto a los niveles de ARNm de HO-1, uno de los marcadores relacionados con la dinámica del hierro también aumentó en la administración de 2-DG (Fig. 6c). Los niveles de ARNm de FTH1 aumentan con el tratamiento con cualquiera de los agentes. Sin embargo, el nivel más alto de ARNm de FTH1 se observó con el tratamiento combinado, lo que demuestra el efecto combinado de estos dos agentes (Fig. 6d, Fig. Suplementaria S5b). Además, la expresión de proteínas relacionadas con la ferroptosis, incluidas FTH1, GpX4 y KEAP1, demostró un efecto combinado (Fig. 6e-h). En particular, la expresión de FTH1 y GpX4 aumentó usando CAP y 2-DG. Sin embargo, la expresión de KEAP1 disminuyó usando CAP y 2-DG. Estos resultados implican que los dos agentes, CAP y 2-DG, provocan cambios drásticos en la dinámica del hierro y que la ferroptosis es una de las vías que provocan la muerte celular. Para excluir la posibilidad de otros tipos de muerte celular, incluida la apoptosis, realizamos un análisis de inmunotransferencia para evaluar la expresión de caspasa-3, lo que implica apoptosis (Figura complementaria S6a, b). Además, el tratamiento combinado con 2-DG y otros inductores de ferroptosis, concretamente selenito de sodio, también fue eficaz (Figuras complementarias S7a,b)9,20.

Ambos agentes cambiaron drásticamente la dinámica del hierro. Se observó un cambio en la ferroptosis después de la administración de 5 días de tratamiento con cloranfenicol (CAP) y 2-desoxi-d-glucosa (2-DG) en U87. ( a, b ) Cuantificación de la expresión de ARNm de PTGS2 y CHAC1 (N = 3). (c) Cuantificación de la expresión del ARNm de HO-1 (N = 3). ( d ) Cuantificación de la expresión del ARNm de FTH1 (N = 3). (e) La transferencia Western revela que los niveles de FTH1 y GpX4 aumentaron en ambos agentes, mientras que los niveles de KEAP1 disminuyeron en ambos agentes (N = 3). (f – h) Resultados de la cuantificación. Los valores se presentan como media ± desviación estándar. Se realizó la prueba t de Student (a–c,f) o el análisis de varianza unidireccional ordinario con la prueba de comparación múltiple de Tukey (d,g,h) para evaluar Ct versus CAP versus 2-DG versus CAP + 2- DG. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Teniendo en cuenta los resultados de la expresión de ARNm y proteínas, CAP y 2-DG pueden inducir ferroptosis, lo que enfatiza la eficacia del tratamiento combinado. Para demostrarlo, utilizamos DFO, un quelante del hierro e inhibidor de la ferroptosis. DFO inhibió los efectos de CAP (Fig. 7a, b) y los de 2-DG y CAP con 2-DG (Fig. 7c-e). Teniendo en cuenta estos resultados, la muerte celular causada por CAP y 2-DG fue inhibida por DFO, y uno de los mecanismos de estos agentes es la ferroptosis.

Inhibición de la ferroptosis por deferoxamina (DFO). (a,b) En U87, el ensayo del número de células revela que el cloranfenicol (CAP) y el DFO (50 μM, agregados 72 h después de la inyección de CAP) redujeron la muerte celular después de 5 días. Los valores se presentan como media ± desviación estándar. (N = 3). (c – e) En U87, el ensayo del número de células reveló que 2-desoxi-d-glucosa (2-DG) o CAP + 2-DG y DFO redujeron la muerte celular después de 3 días, donde inicialmente se agregó DFO (50 μM) . Los valores se presentan como media ± desviación estándar. (N = 3). Se realizó una prueba t de Student. **P < 0,01, ***P < 0,001.

Se sabe poco sobre la relación entre el glioblastoma y las mitocondrias. Nos centramos en las mitocondrias porque son orgánulos clave en el tratamiento del glioblastoma21. Además, existen condiciones hipoglucémicas e hipóxicas en el entorno tumoral14,15. En nuestro estudio anterior, nos centramos en el desarrollo del tratamiento del glioblastoma en condiciones de hipoglucemia9. Los hallazgos de este estudio anterior fueron los siguientes: las mitocondrias se activaron en condiciones de falta de glucosa y los agentes antimicrobianos fueron efectivos en condiciones de falta de glucosa. Debido a que el entorno del tumor es hipoglucémico y deficiente en diversos nutrientes, los hallazgos anteriores representaban tratamientos prometedores. Sin embargo, en condiciones de falta de glucosa, el nivel de glucosa (100 mg/L) era mucho más bajo que en condiciones normales de glucosa (1000 mg/L)9. Teniendo en cuenta la heterogeneidad del tumor, algunas lesiones con alto contenido de nutrientes pueden tener niveles de glucosa más altos que las lesiones con bajo contenido de nutrientes. Es importante desarrollar un tratamiento eficaz con diversas concentraciones de oxígeno en condiciones normales y bajas de glucosa para superar estos tumores malignos. Por lo tanto, en este estudio, nos centramos en la glucosa normal y las condiciones hipóxicas y desarrollamos un tratamiento combinado utilizando CAP y 2-DG. Este tratamiento inhibió drásticamente el crecimiento celular en condiciones normales de glucosa, tanto en condiciones normales como hipóxicas. Por tanto, el tratamiento combinado puede resultar prometedor para los pacientes con glioblastoma.

Según nuestros resultados, el tratamiento combinado fue ineficaz en condiciones altas de glucosa (4500 mg/L) en comparación con condiciones normales de glucosa, destacando la importancia de mantener los niveles de glucosa dentro del rango normal. Según un estudio previo, los niveles de glucosa en sangre se asocian con el pronóstico en pacientes con glioblastoma, y los niveles más altos de glucosa resultan en peores pronósticos22. Además, el OCR fue mayor en condiciones de glucosa normal que en condiciones de glucosa alta, lo que sugiere que la terapia dirigida a las mitocondrias es más efectiva en condiciones de glucosa normal que en condiciones de glucosa alta9, considerándose normal una concentración de glucosa de 1000 mg/L en humanos.

La barrera hematoencefálica (BHE) impide que algunos agentes invadan el cerebro23. Por lo tanto, se debe considerar si un agente puede cruzar la BBB. Recientemente, se han desarrollado técnicas nanoterapéuticas para superar la BHE y mejorar el tratamiento del glioblastoma23. De varios agentes disponibles, seleccionamos dos agentes, CAP y 2-DG, que pueden cruzar fácilmente la BHE y afectar directamente a las mitocondrias24,25.

CAP es un agente antimicrobiano que induce disfunción mitocondrial26. Además, este agente se ha utilizado para tratar la meningitis27. Dunkle et al.27 informaron que la concentración sanguínea efectiva para recién nacidos prematuros con infección del sistema nervioso central fue de 46 a 154 μM. Además, una concentración de 100 µM es razonable y menos dañina. Además, cuando se utiliza este agente, se espera un reposicionamiento del fármaco. La metformina se ha utilizado recientemente para tratar cánceres, incluidos los glioblastomas28. Kim et al.28 informaron que el 2-DG combinado con metformina inhibe la proliferación de células de glioblastoma. Investigamos el efecto de la metformina en condiciones de falta de glucosa, y nuestro estudio informó que CAP fue efectivo en condiciones de falta de glucosa9, mientras que la metformina no fue muy efectiva (Figura complementaria S8). Esta diferencia probablemente se deba a diferencias en los mecanismos de acción de estos dos fármacos. CAP inhibe los ribosomas mitocondriales y causa disfunción mitocondrial26. Según se informa, la metformina inhibe el complejo mitocondrial 1; sin embargo, se ha propuesto otra teoría y el mecanismo exacto no ha sido completamente dilucidado29. CAP es eficaz tanto en condiciones normales como en condiciones de falta de glucosa. Por tanto, creemos que CAP es un fármaco clave para el tratamiento del glioblastoma.

El 2-DG se utiliza para tratar cánceres dirigidos a la glucólisis12. Stein y Raez realizaron un ensayo clínico para tratar cánceres o tumores sólidos utilizando 2-DG y presentaron su seguridad en concentraciones adecuadas. Stein recomendó una dosis de 45 mg/kg, mientras que Raez recomendó una dosis segura de 63 mg/kg/día12,13. Además, la Cmax de una dosis de 45 mg/kg es de 73,7 μg/ml (449 μM), mientras que la de una dosis de 63 mg/kg/día es de 116 μg/ml (casi 700 μM). Sin embargo, Sasaki et al.30 informaron que, aunque la 2-DG trata con éxito el cáncer, dosis eficaces inducen efectos adversos graves. Por lo tanto, recomendaron un nuevo dispositivo que administra 2-DG en nanopartículas de ácido poliláctico-co-glicólico. En nuestro estudio, la concentración de 2-DG fue de 300 μM, que se encuentra dentro del rango seguro.

2-DG inhibe la glucólisis y proporciona condiciones similares a la falta de glucosa. En condiciones de falta de glucosa, como se informó anteriormente, las mitocondrias se vuelven dominantes. 2-DG también aumenta la expresión de COX1 y OXPHOS, lo que implica dominancia mitocondrial. Además, consideramos que esta privación de nutrientes conduce a una mayor actividad de oxidación de ácidos grasos y suponemos que el aumento de OXPHOS se debe a activaciones de ácidos grasos. El etomoxir se utiliza para detectar la actividad de oxidación de ácidos grasos y se informa que dosis altas de etomoxir inhiben el complejo mitocondrial 131. OXPHOS disminuyó después de la inyección de etomoxir, aunque la disminución fue menor de lo esperado. Por tanto, puede haber otras vías, incluida la vía de los aminoácidos. Se necesita más investigación para dilucidar esto.

Según los resultados del estudio, es posible que se haya producido ferroptosis. Recientemente se han informado varios marcadores de ferroptosis, incluidos KEAP1, NRF2, HO-1, GpX4, TFRC, FTH1 y xCT17. Un estudio previo ha demostrado que CAP induce ferroptosis a través de la vía p-p62-KEAP1-NRF2-HO-19. En este estudio, utilizamos dos agentes diferentes; Por lo tanto, fue difícil confirmar la existencia de una única corriente de ferroptosis. Sin embargo, los dos agentes afectaron drásticamente la dinámica del hierro y mostraron un efecto combinado sobre FTH1, GpX4 y KEAP1. Además, para confirmar si estos agentes inducen ferroptosis, es importante utilizar un inhibidor de esta vía; utilizamos DFO en consecuencia. El DFO inhibió ambos agentes y creemos que el mecanismo subyacente a la muerte celular, en este caso, es la ferroptosis. En este estudio, evaluamos otras vías de muerte celular, incluidas la apoptosis y la necroptosis. La expresión de caspasa 3, que implica apoptosis, no cambió en cada agente. Además, no se detectó un aumento en el nivel de ARNm de RIP3K, que está relacionado con la necroptosis. Además, una de las razones por las que la 2-DG causa ferroptosis puede ser que la privación de glucosa induce el bloqueo de la vía de síntesis de serina, una vía derivada de la glucólisis32. Esto conduce al agotamiento del glutatión, un activador de GpX4 que protege contra la ferroptosis33.

Una limitación de este estudio es que los datos se recopilaron in vitro en lugar de in vivo; por tanto, se requieren más estudios in vivo en ratones. Sin embargo, vale la pena informar sobre el desarrollo de un tratamiento eficaz. En conclusión, desarrollamos un tratamiento eficaz que combina CAP con 2-DG para tratar líneas celulares de glioblastoma en condiciones normales de glucosa. Por tanto, los resultados de nuestro estudio parecen beneficiosos para el desarrollo de tratamientos para el glioblastoma.

U87MG (U87) y U373 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.) (certificada por BEX [Japón]). El uso de líneas celulares para este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Escuela de Graduados en Ciencias Médicas de la Universidad de Kyushu. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los pacientes.

Las células se cultivaron, como se informó anteriormente9. De manera similar, se cultivó una línea celular de glioblastoma original derivada de un paciente, KNS1451, obtenida del Banco de Tumores Cerebrales de la Universidad de Kyushu, como se informó anteriormente9. El análisis genético reveló que KNS1451 albergaba mutaciones, como el homólogo de fosfatasa y tensina, la proteína tumoral 53, la neurofibromatosis 1 y el promotor de la transcriptasa inversa de la telomerasa C250T. Esta línea celular se clasifica como de tipo mesenquimatoso agresivo.

Se realizó PCR en tiempo real, como se describió anteriormente9. Se evaluó el ARNr ribosómico 18S como control interno. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla complementaria S1.

Se realizó un análisis de inmunotransferencia, como se describió anteriormente9. En este estudio se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-MTCO1 monoclonal de ratón (#ab14705, Abcam, RRID:AB_2084810), anti-β-actina monoclonal de ratón (#A5441, Sigma-Aldrich, RRID_2766243), anti-GPX4 policlonal de conejo (# 52455, CST, RRID:AB_2924984), anti-KEAP1 monoclonal de conejo (#8047, CST, RRID:AB_10860776), anti-FTH1 policlonal de conejo (#3998, CST), anti-Caspasa-3 policlonal de conejo (#9662, CST) , anticuerpo monoclonal de conejo anti-HIF-1α (#14179, CST, RRID:AB_2622225), anti-IgG de conejo unido a HRP (#7074, CST) y anti-IgG de ratón unido a HRP (#7076, CST). Las membranas se cortaron antes de la hibridación con anticuerpos.

Las células se sembraron (1 x 105 en una placa de 6 pocillos excepto la de la Fig. 1 en la que se sembraron 2 x 104 células) por triplicado y se cultivaron en DMEM (que contiene glucosa, CAP (034-10572, Wako), 2 -DG (D8375, Sigma-Aldrich), DFO (205-314-3, Sigma-Aldrich), SS (10102-18-8, WAKO) y metformina (1115-70-4, Tokyo Chemical Industry) en cada concentración Este medio de cultivo se reemplazó cada 3 días, las células se tripsinizaron y se contaron usando un contador Coulter (Beckman Coulter, EE. UU.) o un contador celular automatizado TC 20 (BIO-RAD, #1450101J1, EE. UU.) con azul tripán. de células similares a células madre, las células (5 x 104 en una placa de 6 pocillos) se sembraron por triplicado o más y se cultivaron en DMEM/Ham's F12 (que contenía CAP y 2-DG en cada concentración) durante 7 días. Después de centrifugar a 3000 xg durante 2 minutos, los sedimentos celulares se tripsinizaron, se agregaron al medio y se contaron usando el contador celular automatizado TC 20 con azul tripán.

Las condiciones hipóxicas se lograron utilizando una incubadora personal multigas de CO2 (ASTEC) con 1% de O2 y 5% de CO2. La concentración de O2 fue verificada automáticamente por un cambiador automático de cilindros de gas (modelo 8420, Waken).

El OXPHOS mitocondrial y la actividad glicolítica se pueden medir utilizando los métodos OCR con un analizador XFe24 (Seahorse Biosciences, EE. UU.). El OCR basal se midió utilizando el analizador de flujo Seahorse XF24, como se describió anteriormente9. Además de esto, la actividad de los ácidos grasos se puede medir utilizando etomoxir 40 µM (n.° 1905, sigma-aldrich) y l-carnitina 0,5 mM (n.° 541-15-1, TCI)18,19. Se sembraron microplacas Seahorse XF24 con 1 x 105 células/pocillo (antes de sembrar, las células se incubaron durante 2 días en cada condición) y se incubaron a 37 °C durante aproximadamente 16 h. Después del análisis, las células se sembraron con un número similar de células en otra placa de 96 pocillos, se tripsinizaron y se contaron al inicio del análisis. Los resultados se normalizaron al número de células.

Los análisis estadísticos se describen en las leyendas de las figuras. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Las diferencias significativas entre los grupos se examinaron mediante un análisis de varianza unidireccional o la prueba t de Student con GraphPad Prism versión 9 (GraphPad Prism Software Inc.). Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.

Se incluyen todos los datos generados o analizados durante este estudio.

Bao, Z. et al. La glucosa alta promueve el crecimiento de las células del glioblastoma humano al aumentar la expresión y función de los receptores quimioatrayentes y del factor de crecimiento. Traducción Oncol. 12, 1155-1163 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ostrom, QT y cols. Informe estadístico CBTRUS: Tumores primarios del cerebro y del sistema nervioso central diagnosticados en los Estados Unidos en 2008-2012. Neuro. Oncol. 17, iv1-iv62 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Stupp, R. y col. Radioterapia más temozolomida concomitante y adyuvante para el glioblastoma. N. inglés. J. Med. Rev. 352, 987–996 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chen, W. y col. Terapias óptimas para el glioblastoma recurrente: un metanálisis de red bayesiana. Frente. Oncol. 11, 641878 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiapaer, S., Furuta, T., Tanaka, S., Kitabayashi, T. y Nakada, M. Posibles estrategias para superar la resistencia a la temozolomida en el glioblastoma. Neurol. Medicina. Chir. (Tokio) 58, 405–421 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Wallace, DC Mitocondrias y cáncer: aborda Warburg. Puerto de primavera fría. Síntoma. Cuant. Biol. 70, 363–374 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Vyas, S., Zaganjor, E. & Haigis, MC Mitocondrias y cáncer. Celda 166, 555–566 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ashton, TM, McKenna, WG, Kunz-Schughart, LA y Higgins, GS La fosforilación oxidativa como objetivo emergente en la terapia del cáncer. Clínico. Res. Cáncer. 24, 2482–2490 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Miki, K., Yagi, M., Yoshimoto, K., Kang, D. y Uchiumi, T. Disfunción mitocondrial y crecimiento deficiente de líneas celulares de glioblastoma causado por agentes antimicrobianos que inducen ferroptosis en condiciones de falta de glucosa. Oncogénesis 11, 59 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, D. y col. 2-desoxi-D-glucosa dirigida al metabolismo de la glucosa en células cancerosas como terapia potencial. Cáncer Lett. 355, 176–183 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Singh, D. y col. Optimización de la radioterapia contra el cáncer con estudios de aumento de dosis de 2-desoxi-D-glucosa en pacientes con glioblastoma multiforme. Strahlenther. Onkol. 181, 507–514 (2005).

Artículo PubMed Google Scholar

Stein, M. y col. Dirigirse al metabolismo tumoral con 2-desoxiglucosa en pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración y neoplasias malignas avanzadas. Próstata 70, 1388-1394 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Raez, LE et al. Un ensayo de fase I de aumento de dosis de 2-desoxi-D-glucosa sola o combinada con docetaxel en pacientes con tumores sólidos avanzados. Quimioterapia contra el cáncer. Farmacéutico. 71, 523–530 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tanaka, K. y col. Las células de glioma requieren un metabolismo de un carbono para sobrevivir a la falta de glutamina. Acta Neuropathol. Comunitario. 9, 16 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Junttila, MR & de Sauvage, FJ Influencia de la heterogeneidad del microambiente tumoral en la respuesta terapéutica. Naturaleza 501, 346–354 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Matsumoto, T. y col. La doxiciclina induce la apoptosis a través del estrés del RE de forma selectiva en células con propiedades similares a las de las células madre cancerosas: importancia de la plasticidad de las células madre. Oncogénesis 6, 397 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, J. y col. Ferroptosis: Pasado, presente y futuro. Enfermedad por muerte celular. 11, 88 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

van der Windt, GJ y cols. La capacidad respiratoria mitocondrial es un regulador crítico del desarrollo de la memoria de las células T CD8+. Inmunidad 36, 68–78 (2012).

Artículo PubMed Google Scholar

Kim, SJ y cols. La inhibición dual de CPT1A y G6PD suprime las esferas tumorales de glioblastoma. J. Neurooncol. 160, 677–689 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Subburayan, K., Thayyullathil, F., Pallichankandy, S., Cheratta, AR y Galadari, S. Ferroptosis mediada por superóxido en células cancerosas humanas inducidas por selenito de sodio. Traducción Oncol. 13, 100843 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Iranmanesh, Y. et al. El papel de las mitocondrias en el mantenimiento de las células madre cancerosas en el glioblastoma. Frente. Oncol. 11, 582694 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tieu, MT et al. Impacto de la glucemia en la supervivencia de pacientes con glioblastoma tratados con radiación y temozolomida. J. Neurooncol. 124, 119-126 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, L., Feng, Y., Gao, S., Mu, Q. y Liu, C. Nanoterapia para superar la barrera hematoencefálica para el tratamiento del glioblastoma. Frente. Farmacéutico. 12, 786700 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van de Beek, D., Brouwer, MC, Thwaites, GE y Tunkel, AR Avances en el tratamiento de la meningitis bacteriana. Lanceta 380, 1693-1702 (2012).

Artículo PubMed Google Scholar

Shah, SS y cols. Dirigirse a las células madre de glioblastoma con 2-desoxi-D-glucosa (2-DG) potencia la respuesta de proteína desplegada (UPR) inducida por radiación. Cánceres 11, 159 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, CH, Cheng, YW, Liao, PL, Yang, YT & Kang, JJ El cloranfenicol causa estrés mitocondrial, disminuye la biosíntesis de ATP, induce la expresión de metaloproteinasa-13 de matriz e invasión de células tumorales sólidas. Toxico. Ciencia. 116, 140-150 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dunkle, LM Concentración de cloranfenicol en el sistema nervioso central en bebés prematuros. Antimicrobiano. Agentes Chemother. 13, 427–429 (1978).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, EH y cols. Inhibición de las esferas tumorales de glioblastoma mediante tratamiento combinado con 2-desoxiglucosa y metformina. Neuro. Oncol 19, 197–207 (2017).

CAS PubMed Google Académico

Feng, J. y col. Las mitocondrias como objetivo importante de la metformina: mecanismo de acción, efectos tóxicos y secundarios, y nuevas aplicaciones terapéuticas. Farmacéutico. Res. 177, 106114 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sasaki, K. y col. La administración de 2-desoxi-D-glucosa mediada por nanopartículas induce inmunidad antitumoral y citotoxicidad en tumores hepáticos en ratones. Celúla. Mol. Gastroenterol. Hepatol. 11, 739–762 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yao, CH et al. La identificación de los efectos no deseados del etomoxir revela que la carnitina palmitoiltransferasa I es esencial para la proliferación de células cancerosas independientemente de la betaoxidación. PLoS Biol. 16, e2003782 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Amelio, I., Cutruzzola, F., Antonov, A., Agostini, M. & Melino, G. Metabolismo de la serina y la glicina en el cáncer. Tendencias Bioquímica. Ciencia. 39, 191-198 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ursini, F. & Maiorino, M. Peroxidación lipídica y ferroptosis: el papel de GSH y GPx4. Radical libre. Biol. Medicina. 152, 175–185 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

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Este trabajo fue apoyado por los números de subvención KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (JP20H00530, JP21K11678, JP22H03537).

Departamento de Química Clínica y Medicina de Laboratorio, Escuela de Graduados en Ciencias Médicas, Universidad de Kyushu, Higashi-Ku, Fukuoka, 812-8582, Japón

Kenji Miki, Mikako Yagi, Yura Do, Dongchon Kang y Takeshi Uchiumi

Departamento de Neurocirugía, Escuela de Graduados en Ciencias Médicas, Universidad de Kyushu, Higashi-Ku, Fukuoka, 812-8582, Japón

Kenji Miki, Naoki Noguchi, Ryosuke Otsuji, Daisuke Kuga y Koji Yoshimoto

Departamento de Ciencias de la Salud, Escuela de Graduados en Ciencias Médicas, Universidad de Kyushu, Higashi-Ku, Fukuoka, 812-8582, Japón

Mikako Yagi y Takeshi Uchiumi

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Experimento de KM, curación de datos, análisis de datos, metodología y revisión de redacción de manuscritos; MI metodología, supervisión, recursos y financiación; NN y RO provisión de muestras clínicas; supervisión de YD; Supervisión de DK y suministro de muestras clínicas; Metodología, supervisión, recursos y financiación de DK; Conceptualización, metodología, supervisión y revisión de KY; Conceptualización, supervisión, recursos, financiación y revisión de la TU.

Correspondencia a Takeshi Uchiumi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Miki, K., Yagi, M., Noguchi, N. et al. Inducción de ferroptosis de células de glioblastoma mediante tratamiento combinado con cloranfenicol y 2-desoxi-d-glucosa. Representante científico 13, 10497 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37483-5

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Recibido: 25 de enero de 2023

Aceptado: 22 de junio de 2023

Publicado: 28 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37483-5

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